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Phos-tag™ SDS-PAGE凝膠制膠方法2——凝膠制備
播放：2463 上傳時(shí)間：2019-08-06抱歉，由于流量限制，視頻無(wú)法播放。
Phos-tag™ Acrylamide
SDS-PAGE分離不同磷酸化水平的蛋白！
在不使用放射性同位素的情況下，利用Phos-tag™ SDS-PAGE即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于Western blotting和質(zhì)譜分析等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Phos-tag™ SDS-PAGE操作簡(jiǎn)單，只需在常規(guī)SDS-PAGE膠中加入Phos-tag™ Acrylamide 和Mn2+或者Zn2+即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在電泳過(guò)程中，磷酸化蛋白的磷酸基團(tuán)與Phos-tag™中的二價(jià)金屬離子相結(jié)合，降低其遷移速度，從而可區(qū)分磷酸化與非磷酸化蛋白。
◆原理
◆優(yōu)點(diǎn)、特色
● 采用Phos-tag™ SDS-PAGE可輕松分離磷酸化蛋白
無(wú)任何放射性元素及化學(xué)標(biāo)記！
● 可檢測(cè)不同磷酸化水平的磷酸化蛋白
無(wú)需任何磷酸化抗體！
● 適用于內(nèi)源性蛋白的磷酸化分析！
◆案例、應(yīng)用
【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】
我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究科 小川覺(jué)之
Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開(kāi)發(fā)出來(lái)的試劑。此產(chǎn)品使用方便，不但可用于體外實(shí)驗(yàn)，還能定量分析體內(nèi)蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常規(guī)電泳實(shí)驗(yàn)，無(wú)需購(gòu)買特殊設(shè)備，性價(jià)比高。傳統(tǒng)蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑，操作復(fù)雜，花費(fèi)大，且放射性元素會(huì)有安全隱患，而Phos-tag ™ 的出現(xiàn)恰恰可以彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖
Lane 1 為非磷酸化蛋白，Lane 2-5 為磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化狀態(tài)不同而條帶遷移率也有所不同。
磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數(shù)量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據(jù)條帶遷移和條帶濃度求得。
【資料提供】
日本東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科
【二維電泳中的應(yīng)用：分析hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體】
小鼠巨噬細(xì)胞J774.1 經(jīng)LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過(guò)免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點(diǎn)代表不同的亞型或修飾蛋白。
二維電泳
同一個(gè)等電點(diǎn)的位置上，不同位點(diǎn)發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開(kāi)來(lái)（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【參考文獻(xiàn)】
Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【結(jié)果提供】
橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化學(xué)研究所RCAI 小原收
【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】
常規(guī)SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實(shí)驗(yàn)分析EGF 刺激的A431 細(xì)胞中MAPK 磷酸化水平。
摘自Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.
◆產(chǎn)品列表
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 包裝 |
| 304-93526 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液 | 蛋白研究 | 0.3 mL |
| 300-93523 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 Phos-tag 丙烯酰胺 | 蛋白研究 | 2 mg |
| 304-93521 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 Phos-tag 丙烯酰胺 | 蛋白研究 | 10 mg |
| 134-15302 | Manganese(II) Chloride Tetrahydrate氯化錳四水合物 | for Molecular Biology | 25 g |
